圖片來源：David Parkins

RNA分子在人體中承擔著信使的角色。通過在細胞間進出，它能夠完成機體組織間的信息交流。因此對科學(xué)家們而言，通過檢測RNA來診斷疾病似乎理所應(yīng)當。他們認為，通過檢測血液、唾液、尿液以及其它體液中攜帶的RNA分子，就應(yīng)該可以知曉檢測者的健康情況。

但現(xiàn)實情況卻復(fù)雜得多?！拔覀冊谶@件事情上，都有點天真了?！奔又荽髮W(xué)圣迭戈分校（UCSD）的圍產(chǎn)學(xué)家Louise Laurent表示。

Laurent致力于開發(fā)微創(chuàng)性的RNA檢測技術(shù)，以用于癌癥、心臟病、神經(jīng)退行性疾病以及其它疾病的早期篩查和臨床管理。目前越來越多的科學(xué)家從事這一領(lǐng)域，但胞外RNA（extracellular RNA, exRNA）的多樣性以及RNA運輸系統(tǒng)的復(fù)雜性，都給這一過程帶來了巨大的挑戰(zhàn)。“我覺得我們都低估了生物系統(tǒng)的復(fù)雜程度?！盠aurent表示。她目前正在研究用exRNA來預(yù)測妊娠過程中的一些并發(fā)癥。

RNA的多樣性會導(dǎo)致檢測時存在大量的分子背景噪音，很難從中辨別出具有臨床意義的生物標志物。不僅如此，由于目前存在的技術(shù)難題都與exRNAs的收集、處理和分析有關(guān)，因此不同實驗室的實驗結(jié)果間難以進行比較，而這種比較又恰恰是發(fā)現(xiàn)并驗證exRNA生物標志物的必需步驟。

以分離胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的方法為例。胞外囊泡是由脂肪分子構(gòu)成的膜狀結(jié)構(gòu)，其大小一般為人體細胞的千分之一。它可以運輸RNA，并保護RNA不被體液中的RNA酶降解。通過對囊泡相關(guān)的約1700個實驗進行分析，研究者們發(fā)現(xiàn)僅從體液中提取囊泡的方法就超過了1000種1。這些方法的區(qū)別往往很小，比如用于樣品離心的轉(zhuǎn)子型號等。但該項目研究者An Hendrix指出，“這些差別看似微小，但卻會對提取的囊泡造成很大的影響?！盇n Hendrix同時也是比利時根特大學(xué)的一位研究胞外囊泡的癌癥生物學(xué)家。

在過去五年中，exRNA診斷的相關(guān)研究越來越多，與之對應(yīng)的是大學(xué)和公司都想要將這些成果轉(zhuǎn)化為可應(yīng)用的醫(yī)學(xué)技術(shù)。目前生物機制和實際應(yīng)用兩方面均取得一定進展，因此科學(xué)家們開始探索RNA如何感知自身是否被包裹在囊泡或其它載體中，以及RNA在不同生理或病理條件下發(fā)揮的作用。

另一方面，得益于諸如胞外RNA通訊聯(lián)盟（Extracellular RNA Communication Consortium, ERCC）這樣的相關(guān)倡議，exRNA檢測的標準度和重復(fù)性正在不斷提高。該聯(lián)盟由美國國立衛(wèi)生研究院（US National Institutes of Health, NIH）于2013年發(fā)起，是一個耗費1.6億、跨度十年的項目，旨在促進基于exRNA的診斷和治療方法的臨床研發(fā)工作。

盡管這些方法要應(yīng)用于臨床實踐，還存在諸多困難，例如如何獲取高純度的囊泡等。但也有一些基于體液中exRNA的液體活檢方法已經(jīng)進入市場，可以為癌癥診斷結(jié)果不明的病人提供更多有用信息。以同樣的思路，可以針對其它疾病開發(fā)出對應(yīng)的RNA分子探針。

Danilo Tagle是一位分子遺傳學(xué)家，同時也在NIH屬下的美國推進轉(zhuǎn)化科學(xué)中心（National Center for Advancing Translational Sciences）馬里蘭貝塞斯達分部工作。他是負責(zé)特殊項目的副總監(jiān)，目前正在幫助ERCC進行協(xié)調(diào)組織工作。Tagle表示，“這個行業(yè)發(fā)展十分迅速，這推動著公司們將其中一些方法盡快商業(yè)化?！?/p>

體液檢測

在馬薩諸塞州沃爾瑟姆市的一個實驗室里，技術(shù)員們每月通常需要處理上千個尿液樣本。他們需要從每個樣本中提取出所有的胞外囊泡，再從囊泡中分離出RNA。

這就是Exosome Diagnostics公司的所在地。它是Bio-Techne的下屬公司，也是世界上第一家將基于胞外囊泡的診斷方法應(yīng)用于臨床實踐的公司。這個方法被稱為ExoDx，它是專門為血液中前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）含量略微偏高的老年男性設(shè)計的，可以幫助他們確定是否需要對前列腺進行活體組織檢查。

前列腺活檢需要將大頭針頭粗細的針插入到直腸中，然后吸取一小截組織。這個過程非常痛苦，并且有可能會出現(xiàn)出血、感染和膀胱相關(guān)的后遺癥。但如果不做前列腺活檢，則很難判斷血液中PSA含量為2-10 ng/mL的這部分人群的健康狀況。他們有可能患有高度惡性腫瘤，需要盡快切除；但也有可能只需要進行醫(yī)學(xué)觀察即可。根據(jù)目前的估計，處于這個“灰色地帶”的人群中，含有惡性腫瘤的人數(shù)少于25%。

ExoDx旨在讓更少的人經(jīng)受活檢以及后續(xù)的過度醫(yī)療的折磨。它需要對尿液中的胞外囊泡里含有的三種RNA分子進行量化檢測。其中兩種分別與原癌和抑癌基因有關(guān)，另一種則與前列腺癌發(fā)展所需的一個非編碼RNA的基因有關(guān)。通過檢測這些基因的相對活性，ExoDx可以預(yù)測檢測者患有惡性前列腺癌的可能性。

在兩項臨床試驗中，研究者對超過1000名PSA含量為中等水平的男性進行了ExoDx檢測。結(jié)果表明ExoDx極為準確地分辨出了其中可能患有癌癥并需要進行活檢的人，以及病情較輕、可以繼續(xù)觀察的人。

圖源：pixabay

目前該公司正在積極開發(fā)其它臨床領(lǐng)域的業(yè)務(wù)。包括正在研發(fā)的第二個基于胞外囊泡的尿液檢測方法，它可以在術(shù)前預(yù)測腎移植受者對移植腎是否存在免疫排斥反應(yīng)。另一個正在研發(fā)的血液檢測，可以基于exRNA和循環(huán)腫瘤基因（circulating tumour DNA），檢測肺癌病人存在的基因突變。正如Exosome公司的聯(lián)合創(chuàng)始人和首席科學(xué)官Johan Skog所說，“這不僅僅是一種診斷方法，這是一個平臺。”

也有許多其它分子診斷公司和學(xué)術(shù)研究團隊想要將exRNA用以識別癌癥的早期征兆或者輔助進行疾病的危險度分層。例如位于加利福尼亞州森尼韋爾市的Cepheid公司以及位于新西蘭達尼丁市的Pacific Edge公司，他們可以通過檢測尿液中五種編碼RNA的含量，篩查早期膀胱癌或者監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)兆。該方法與Exosome的尿液檢測方法思路一致，都是通過收集腫瘤源附近的體液，然后檢測其中癌癥特異性的RNA分子。相同的方法也被用于檢測脊髓液中腦癌相關(guān)的RNA分子以及唾液中口腔癌相關(guān)的RNA分子。但也有一些腫瘤會將RNA分子擴散至全身。

對這些擴散至全身的RNA分子，大多數(shù)團隊都想在血液中進行檢測。但加州大學(xué)洛杉磯分校（University of California, Los Angeles）的口腔生物學(xué)家David Wong卻表示這些RNA在唾液中也能被檢測到。通過與首爾三星醫(yī)學(xué)中心（Samsung Medical Center）的臨床研究者合作，Wong對約2500名受試者的唾液進行了檢測。結(jié)果表明，唾液中含有的九種人體或細菌來源的RNA，可以用于預(yù)測檢測者患胃癌的可能性。后者是目前韓國最常見的癌癥類型。

唾液檢測

如果我們的眼光不僅僅局限于目前常用的體液檢測的話，那么除exRNA外的其它分子或許同樣可以用于醫(yī)學(xué)診斷。正是基于這樣的思路，位于美國加利福尼亞州南舊金山的Freenome公司正在嘗試采用多組學(xué)的方法。除了血液中的RNA之外，他們還將對蛋白質(zhì)、DNA、表觀生物標志物以及其它的疾病循環(huán)標志物進行檢測。通過這樣的方法，他們希望能夠獲取癌癥全方面的生物特征，從而解決結(jié)腸癌早期篩查中存在的問題——目前用于結(jié)腸癌早期篩查的腸鏡，由于侵入性強、較為痛苦，所以很多患者不愿意進行檢測。

“我們需要盡可能地結(jié)合多種診斷方法，”Freenome公司的首席科學(xué)官Jimmy Lin表示。“單一的標志物反映的信息不夠全面”，因此很難通過一種物質(zhì)來進行癌癥診斷。

在今年的某個會議上，F(xiàn)reenome公司的科學(xué)家們介紹道，他們通過機器學(xué)習(xí)算法搭建的平臺，可以對大量的生物數(shù)據(jù)進行篩選，并最終選出其中超過90%的結(jié)腸癌病例。其預(yù)測性甚至好于最近通過批準的一項糞便檢測方法，該方法也是目前腸鏡的唯一替代方法。

也有一些新興的公司，嘗試將exRNA用于心腦疾病領(lǐng)域。例如，馬薩諸塞州列克星敦市的Dyrnamix公司就正在研發(fā)一種可以為心血管疾病患者提供個性化療法的exRNA診斷技術(shù)。與此同時，離納蒂克不遠的Neurodex公司，正在嘗試從血液中分離神經(jīng)元產(chǎn)生的外泌體，并提取其中的RNA和蛋白質(zhì)進行檢測，希望能夠找到阿爾茨海默病的早期標志物。

Johan Skog正在馬薩諸塞州沃爾瑟姆的Exosome公司中處理樣本。

圖片來源：Johan Skog，Exome Diagnostics

Neurodex的首席科學(xué)官、神經(jīng)學(xué)家Erez Eitan表示，“總的說來，研究神經(jīng)的人不太喜歡RNA?！彼忉尩?，與癌癥不同，神經(jīng)疾病的病理學(xué)特征不在DNA或RNA層面，而主要在蛋白質(zhì)層面。所以研究者們對RNA在神經(jīng)退行中的作用知之甚少。

這部分解釋了為什么用于阿爾茨海默病前期診斷的大多血液檢測方法，都是測量淀粉樣蛋白、活化tau蛋白以及其它在大腦中積累并造成這種疾病的蛋白。但這就像是通過翻找一個人的垃圾桶，來判斷他的生活方式，Victoria Risbrough表示。Risbrough是一名神經(jīng)學(xué)家，在美國退伍軍人事務(wù)部（Veterans Affairs）屬下的應(yīng)激與心理健康卓越中心（Center of Excellence for Stress and Mental Health）工作。她認為要了解這些疾病，更好的方法是通過相關(guān)細胞間的信息交流方式，而這恰恰是exRNA的功能。

“RNA可以讓你知道什么是造成病理現(xiàn)象的可能原因?！盧isbrough表示。目前她正在與加州大學(xué)圣迭戈分校的神經(jīng)病理學(xué)家Robert Rissman合作，共同開發(fā)一項用于創(chuàng)傷性腦損傷的診斷方法?！拔覀儾皇欠依?，而是直接看它們之間交流的信息。”

附加價值

盡管開發(fā)出一種能對腦部疾病進行全面篩查的檢測方法，仍然是最終的目標。但新澤西州蒙默斯匯合站的DiamiR公司共同創(chuàng)始人和董事長Kira Sheinerman表示，對實驗性療法進行臨床試驗的醫(yī)藥公司可能會成為大多數(shù)exRNA診斷的首批客戶。

DiamiR公司在血液中找到了炎癥相關(guān)的microRNA，并且該RNA分子在大腦中含量較高。通過檢測microRNA的含量，他們可以預(yù)測目前沒有認知障礙的老人，在未來是否會罹患阿爾茨海默病，其準確度可達到84%。Sheinerman表示，藥物開發(fā)者和臨床研究者可以利用該檢測，來辨別出處于阿爾茨海默病前期的患者，并邀請他們作為正在評估的實驗性療法的志愿者。

另一方面，即使這些exRNA檢測最終沒有被廣泛使用，“它們?nèi)匀豢梢詭椭覀儗膊〗⑿碌募僭O(shè)。”神經(jīng)學(xué)家Jeseph Quinn表示，他目前在位于波特蘭的俄勒岡健康與科學(xué)大學(xué)（Oregon Health and Science University）工作。Quinn與分子神經(jīng)生物學(xué)家Julie Saugstad合作，發(fā)現(xiàn)了一系列可用于診斷阿爾茨海默病的microRNA。這些RNA分子可以作為新的分子靶點，用于新藥的研發(fā)。但同時Quinn也表示，其發(fā)揮作用的具體生物機制仍未被闡明。因此，和大多數(shù)的研究者一樣，他們對exRNA診斷的研究仍然處于初期探索階段。

目前該領(lǐng)域的研究問題之一，就是如何更好地分離胞外囊泡。盡管一些研究者已經(jīng)可以不經(jīng)胞外囊泡，直接獲得exRNA，但這種方法常常會在分析RNA時，遺失一些細節(jié)。因此，研究者們正在逐漸拋棄對人體體液進行全RNA測序的方法，而更傾向于對目標器官分泌的囊泡中的RNA進行精準分析?！斑@種方法可以直接鎖定信息來源。”Dyrnamix公司共同創(chuàng)始人，也是波士頓馬薩諸塞州總醫(yī)院（Massachusetts General Hospital）的心臟電生物學(xué)家Saumya Das表示。

由于不同分子在尺寸和密度上都有差異，所以科學(xué)家們通常會通過離心來分離得到胞外囊泡。但這個方法也存在缺陷?！霸陔x心時會有一些污染，所以我們不能通過離心獲得100%純度的囊泡?！焙商m烏得勒支大學(xué)（Utrecht University）的免疫細胞學(xué)家Esther Nolte-’t Hoen表示。

目前研究者們正在開發(fā)分離胞外囊泡的新方法。例如通過大小不同的小孔過濾得到囊泡，或者利用親和性物質(zhì)，結(jié)合樣品中的囊泡以實現(xiàn)分離。但無論是哪種方法，都需要一種標準參照物來進行校準，而這最近才得以實現(xiàn)。

去年，根特大學(xué)的Hendrix和她的同事研發(fā)出了一種可追蹤的工程化胞外囊泡。將其注射進體液中，并進行追蹤，就可以驗證樣品制備和分析方法的準確性4。“長期以來，這個領(lǐng)域都在尋找這樣一個標準參照物?！盚endrix表示。她將這種可追蹤的囊泡分享給了許多實驗室，“每次我參加會議，展示這一技術(shù)時，都有許多人請求我分享這一技術(shù)。

Hendrix、Nolte-’t Hoen以及其他研究者都積極地參與到社區(qū)建設(shè)和數(shù)據(jù)記錄的相關(guān)倡議中，以確保疾病診斷等關(guān)于含有RNA的胞外囊泡的研究，可以被恰當?shù)卦忈尯椭貜?fù)?！斑@或許不是科學(xué)意義上最令人興奮的那些事，但卻是必不可少的一部分?！盢olte-’t Hoen表示。

同時，NIH通過其數(shù)億美元的項目，正在尋找更好的分離特定的胞外囊泡并分析其中RNA分子的方法。目前正在研發(fā)的exRNA診斷中很少能達到這個精確度，甚至其中大部分都不需要對胞外囊泡進行提純，這種純度對臨床應(yīng)用來說是可以接受的。

但Tagle表示，“為了說明研究的嚴謹性，科學(xué)家需要知道為什么會出現(xiàn)這樣的結(jié)果。這就會讓研究者更加注重實驗過程，從而產(chǎn)生更可靠和可重復(fù)的結(jié)果?！?/p>

作者：Elie Dolgin是馬薩諸塞州薩默維爾市的一名科學(xué)記者。

翻譯：洪藝瑞

審校：潘燕婷

引進來源：科學(xué)美國人

引進鏈接：https://www.scientificamerican.com/custom-media/nature-outlook-extracellular-rna/could-tracking-rna-in-body-fluids-reveal-disease/


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