■本報記者 韓揚眉

在真核細胞中，RNA可以“形單影只”，也可以與蛋白質(zhì)“珠聯(lián)璧合”。后者被稱為RNA結合蛋白，擁有強大的基因調(diào)節(jié)能力。但RNA究竟與哪些蛋白結合，將怎樣作用于人類的發(fā)育、疾??？這都是懸而未決的問題。

6月10日，中國科學院生物物理研究所研究員薛愿超團隊與合作者開發(fā)了可在微量細胞中鑒定RNA結合蛋白作用靶點的新技術LACE-seq，首次實現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RNA結合蛋白的結合位點，為研究RNA結合蛋白在胚胎發(fā)育和生殖疾病中的功能機制打開了大門。相關成果發(fā)表于《自然—細胞生物》。

尋覓工具

人類基因組共編碼了約1500個RNA結合蛋白，它們往往通過結合RNA分子上的特定基序或結構元件而調(diào)控細胞內(nèi)各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩(wěn)定性等。

研究表明，RNA結合蛋白在早期生殖、個體發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過程中都發(fā)揮了關鍵的調(diào)控作用。同時，RNA結合蛋白的突變會導致多種遺傳性疾病，比如肌肉萎縮性側索硬化癥、骨髓增生異常綜合征等。

因此，準確鑒定RNA結合蛋白的結合靶標及精確結合位置是理解其生理和病理調(diào)控機制的前提。

薛愿超介紹，目前常用的鑒定RNA結合蛋白靶標的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由于這兩種方法都依賴于利用特異性抗體富集RNA結合蛋白及其所結合的RNA，而且需要百萬數(shù)量級的細胞，嚴重限制了其在稀有細胞類型及臨床穿刺樣本中的應用。

比如，由于缺乏可在微量細胞甚至單細胞水平研究RNA結合蛋白靶標的實驗方法，導致人們?nèi)圆磺宄缙谏尺^程中RNA結合蛋白及其復合物的分子機制。

“當前針對RNA結合蛋白的相關技術研究多是在干細胞和體細胞等可以在體外大量擴增的細胞系中進行，而在早期生殖和臨床穿刺等微量樣本中的研究依然是個空白?！毖υ赋嬖V《中國科學報》。

推開大門

曾經(jīng)在華大基因從事兩年RNA相關技術研發(fā)的蘇瑞寶加入薛愿超團隊，成為薛愿超的第二位博士生，為團隊開發(fā)LACE-seq方法奠定了基礎。

為了建立這個方法，蘇瑞寶認真細致地優(yōu)化了每一個實驗條件。在LACE-seq方法搭建完成之后，團隊重點研究了RNA結合蛋白Ago2/endo-siRNA沉默復合物在小鼠MII時期卵細胞中的作用靶標，解析了Ago2/endo-siRNA復合體在卵細胞中調(diào)控mRNA翻譯以及抑制轉座子介導的嵌合體轉錄本生成等一系列新機制和新規(guī)律。

在應用上，團隊利用創(chuàng)建的LACE-seq方法，首次在卵細胞中繪制了Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RNA結合蛋白的具體靶標和結合位置，率先發(fā)現(xiàn)Ago2/endo-siRNA沉默復合物在卵細胞中以非完全互補配對的方式抑制mRNA的翻譯，并證明endo-siRNA的靶標Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質(zhì)水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關。

此外，他們還證明了Ago2/endo-siRNA復合物可切割由逆轉座子啟動子起始的嵌合體RNA，該機制確保了卵細胞中轉錄組的完整性。

LACE-seq技術具有實驗操作時間短、信噪比高、有效數(shù)據(jù)多、成本更加低廉等一系列優(yōu)勢，克服了現(xiàn)有實驗方法的缺點，有效解決了該領域的難題。這些優(yōu)勢使得在珍稀的微量細胞如早期生殖細胞、癌癥干細胞、臨床穿刺樣本中，研究RNA結合蛋白的調(diào)控、致病機理成為了可能。

LACE-seq技術通過線性擴增逆轉錄酶在RNA結合蛋白結合位點處的終止信號，首次實現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RNA結合蛋白的結合位點。

可以說，LACE-seq技術為研究RNA結合蛋白及其復合物在早期生殖、胚胎發(fā)育等過程中調(diào)控基因表達的新規(guī)律打開了大門。

建立圖譜

RNA結合蛋白，英文簡稱RBP。據(jù)相關研究，大約5%~10%的人類蛋白質(zhì)可以與RNA結合。但到目前為止，研究人員尚未對所有RNA結合蛋白進行普查，已知的RBP數(shù)量仍然是估計數(shù)。

RBP關系人類基因奧秘，功能重要。建立起RBP“家族”圖譜，才能更有助于挖掘一個個“金礦”。

美國于2013年啟動了一項大型研究計劃，準備利用增強型的紫外交聯(lián)和免疫共沉淀方法eCLIP來系統(tǒng)解碼RBP的調(diào)控機制，目前已經(jīng)成功繪制了150個RBP的結合圖譜。不過，我國迄今還沒有相關的RBP圖譜研究計劃。

“接下來，我們將與國內(nèi)同行合作，希望快速推動LACE-seq方法的應用，尤其是在生殖及相關疾病中的研究。同時我們希望建立全自動化LACE-seq平臺，以大規(guī)模注釋RBP的功能機制，并發(fā)起有中國特色的RBP圖譜計劃?！毖υ赋f。

相關論文信息：

https://doi.org/10.1038/s41556-021-00696-9